葉挺率鐵軍部隊開進南昌，受到各界群眾的熱烈歡迎。周恩來召集前敵委員會開會，宣布由周恩來、李立三、澎湃、惲代英等人組成前委，周恩來為書記，賀龍為總指揮，葉挺為前敵總指揮，劉伯承為參謀長，并確定了起義時間。葉挺制定了科學嚴密的軍事計劃。而中央代表張國燾以中央和共產國際名義“假傳圣旨”，要求起義“推遲”。惲代英和譚平山等人激烈反對張的機會主義主張，關鍵時刻，前敵總指揮葉挺支持了周恩來等人的正確決策，武裝起義按原計劃進行。

1927年8月1日凌晨2時，南昌起義打響了武裝暴動的第一槍。東方破曉，經過四小時激戰，起義部隊占領了南昌城，起義勝利。上午9時，起義領導人和各界代表在省政府西花廳召開聯席會議，決定整編起義部隊為三個軍，葉挺任第十一軍軍長。成立臨時革命政府“中國國民黨革命委員會”，推舉宋慶齡等25人為委員，并發表《八一宣言》。前敵總指揮葉挺發表《告二方面軍同志書》，深刻揭露了國民黨反動派叛變革命的罪行，產生了深淵的影響。

起義部隊根據中央決定，離開南昌南下廣東，以求得國際援助，準備發起第二次北伐。天氣炎熱，反動派軍隊圍追堵截，加之蔡廷鍇叛逃和三河壩錯誤分兵，起義部隊逐漸陷入絕境。10月3日，身患瘧疾重病的周恩來在流沙鎮召開緊急會議，總結經驗教訓，決定部隊分散突圍，做長期斗爭的準備。風高月黑，葉挺和聶榮臻護送周恩來乘小船渡海逃港，起義宣告失敗。

葉挺回到家里，見到接別的嬌妻和新生的兒子正大，百感交集，心情沉重，猶如籠中困獸，等待革命爆發的時機。